Диагностика рака предстательной железы

Рак предстательной железы (РПЖ) является вторым по частоте и пятым по смертности среди злокачественных новообразований у мужчин в мире. Одной из важных клинических проблем является вопрос дифференциальной диагностики простатита, доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) и РПЖ. Ранняя дифференциальная диагностика ДГПЖ и РПЖ является очень важным моментом в плане улучшения исходов и выживаемости при РПЖ.

Текущая скрининговая диагностика РПЖ включает метод ректального пальцевого исследования с чувствительностью около 37%, определение ПСА, уровень которого повышен как при РПЖ, так и при ДГПЖ, делая дифференциальную диагностику относительно сложным процессом, особенно при значениях ПСА из «серой зоны» 4–10 нг/мл. Еще одним способом диагностики РПЖ является трансректальная биопсия под контролем ультразвука, однако данная методика имеет ограничения.

Перспективным направлением развития диагностики РПЖ являются циркулирующие молекулы микроРНК. Существует множество подтверждений, что микроРНК могут быть гипер- или гипоэкспрессированы в различных злокачественных опухолях. Данные молекулы могут быть выделены из любых биологических жидкостей и определены даже при наличии в очень малых количествах, что делает их перспективными биомаркерами.

Не смотря на то, что на сегодняшний день удалось продемонстрировать диагностическую значимость ряда циркулирующих в крови микроРНК, надёжная методика для применения в практической медицине не создана. Отсутствует общепринятая методика получения плазмы крови для последующего выделения микроРНК, крайне ограничен объем клинических данных о связи микроРНК и РПЖ, не разработаны панели референсных генов для нормализации результатов. Маловероятно, что определение конкретной одиночной микроРНК позволит достичь достаточной диагностической и прогностической точности, так как существуют сообщения о связи одних и тех же типов микроРНК с различными типами опухолей.

Одним из путей решения вышеперечисленных проблем может быть проведение исследований, направленных на поиск новых диагностически-значимых микроРНК с последующим созданием панели из нескольких микроРНК, способных удовлетворить задачи диагностики и прогнозирования РПЖ, как это было сделано для рака поджелудочной железы.

Таким образом, проект направлен на решение актуальной научной проблемы – разработки набора реагентов для диагностики рака предстательной железы и прогноза чувствительности к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы на основе определения уровня пула циркулирующих в плазме крови микроРНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии 23 сентября 2014 г. № 14.579.21.0054 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 01 января 2015 г. по 30 июня 2015 г. выполнялись следующие работы:

Подготовлен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках ПНИ. Проведены патентные исследования. В результате было установлено, что на территории Российской Федерации практически не ведутся исследования по разработке методов диагностики, стадирования и прогнозирования РПЖ и выявления специфичных для неё особенностей на основе определения микроРНК; тенденции развития существующих изобретений указывают на целесообразность поиска перспективных маркеров в крови и её производных методом микрочипового полногеномного анализа и дальнейшей разработки и производства тест-систем на основе ПЦР-РВ; по совокупности полученных данных научные результаты, получаемые в процессе проведения прикладного научного исследования по разработке метода на основе анализа уровня микроРНК в плазме крови для малоинвазивной диагностики рака предстательной железы, могут подлежать правовой охране.

Экспериментально разработана методика получения плазмы крови, позволяющая минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови. Осуществлен сбор венозной крови и сформирована коллекция плазмы крови 382 доноров. Проведён анализ некодирующих РНК в 382 образцах плазмы с помощью микрочипов GeneChip miRNA 4.0 (Affymetrix).

Разработаны варианты технических решений дополнительных реагентов. Для проведения исследовательских испытаний вариантов технических решений реагентов для выделения РНК были выбраны следующие наборы реагентов: miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия); NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL, Германия); Direct-zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, США). Для проведения исследовательских испытаний реагентов для обратной транскрипции: miScript II RT Kit (Qiagen, Германия) и Sensiscript RT Kit (Qiagen, Германия). Для проведения исследовательских испытаний реагентов для проведения полимеразной цепной реакции: набор реагентов для проведения ПЦР-РВ R-412 (Синтол, Россия), реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ М-428 (Синтол, Россия), miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Германия).

Разработаны программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов вариантов технических решений реагентов.

Созданы ксенографтные модели рака предстательной железы с использованием иммунодефицитных мышей и клеточных линии РПЖ человека PC3 и DU145 (по 5 scid мышей для каждой клеточной линии). Адаптирована к специфике ксенографтных моделей разработанная ранее методика получения плазмы крови (оптимизация по критериям максимизации объема единовременного забора крови и минимизации гемолиза). Осуществлен анализ микроРНК в образцах ткани ксенографтов и плазмы крови.

Выбран тип модификации праймеров для достижения заявленных параметров количественного определения микроРНК; осуществлено технико-экономическое обоснование разработки аналитической тест-системы; выполнено сравнительное исследование профиля некодирующих РНК в опухолевой ткани и плазме крови. Сформирована коллекция биологических образцов опухолевой ткани пациентов с РПЖ. Проведен мультиплексный анализ микроРНК в образцах опухолевой ткани на микрочипах высокой плотности GeneChip miRNA 4.0 Array.

Осуществлено оснащение испытательной лаборатории оборудованием для независимой проверки технических и функциональных характеристик образцов аналитической тест-системы. Разработана методика анализа профиля некодирующих РНК в плазме крови для ксенографтных моделей рака предстательной железы, учитывающая гомологию микроРНК человека и мыши. Проведен биоинформационный анализ результатов профилирования миРНома образцов ксенографтов и плазмы крови мышей.

При этом были получены следующие результаты:

В результате исследовательских испытаний реагентов были выбраны следующие варианты технических решений: реагенты для выделения РНК - miRNeasy Serum/ Plasma Kit с гликогеном и колонкой RNeasy MinElute Spin; реагенты для обратной транскрипции - miScript II RT Kit с буфером HiSpec; реагенты для проведения полимеразной цепной реакции - набор реагентов M-428.

В рамках реализации проекта впервые в мире осуществлено крупномасштабное исследование микроРНома плазмы крови пациентов с раком предстательной железы, охватывающее весь спектр микроРНК mirBASE версии 21.

Подтверждение соответствия полученных результатов требованиям к выполняемому проекту будет осуществлено на последующих этапах реализации проекта.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

 

  • НТЦ «БиоКлиникум»
  • ©2011—2017

Контакты

  • Тел.: +7 495 665-33-49
  • Факс: +7 495 665-61-89
  • 115088 Россия, Москва,
    ул. Угрешская, д. 2, стр. 85 «IQ-Park»